产碱性纤维素酶真菌的筛选鉴定及酶学性质研究

摘要:经过初筛和复筛从从碱性土样中分离出的7株产纤维素酶的真菌中获得1株能够产碱性纤维素酶的丝状真菌t42。经18S rRNA基因序列分析和，确定该菌株为镰刀霉菌(Fusarium sp)。酶学性质初步研究显示t42的CMC酶最适作用pH值为7.5，在pH值7.0~8.5的范围内具较高的稳定性;反应温度以50℃左右为宜，且在55℃以下具有较高的温度稳定性;Mg2+､Mn2+和Zn2+对酶反应有促进作用，Pb2+和Cu2+对酶反应有抑制作用。

关键词:碱性纤维素酶;真菌;筛选鉴定;酶学性质

中图分类号: 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2008)08-0899-02

纤维素酶是由多种水解酶组成的一个复杂酶系，主要来自于真菌和细菌。碱性纤维素酶在碱性条件下具有内切β-1，4葡萄糖苷酶活力，因而在洗涤剂､纺织､废水处理和制浆造纸工业等行业中有更好的应用前景[1-3]。但目前研究较多的是木霉(Trichoderma)､曲霉(Aspergillus)属等真菌产生的酸性纤维素酶。酸性纤维素酶在碱性条件下酶活性较低或根本没有活性､稳定性较差､pH值适应范围窄等，这极大限制了纤维素酶在这些行业中的应用。因此筛选产酶性能好的产碱性纤维素酶的菌株有较大的实际意义和应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

碱性土壤､朽木取自湖北咸宁天化纺业有限公司附近。羧甲基纤维素钠培养基(CMC-Na培养

基)[4]:NaCl 6 g，MgSO4•7 H2O 0.1 g，KH2PO4 0.5 g，CaCl2 0.1 g，K2HPO4 2.0 g，CMC-Na 15 g，(NH4)2SO4 2.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH值8~8.5;固体培养基加1.5%琼脂。分离培养基(PDA培养基):马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌株的筛选

1)固体培养初筛 将采集到的碱性土壤､朽木等经无菌水洗涤后，吸取上清液作一系列梯度稀释，将稀释液涂布在选择培养基——羧甲基纤维素钠(CMC-Na)平板上(用前加入适量抗生素来抑制细菌生长)，28℃倒置恒温培养;分离筛选生长旺盛，并在刚果红染色､NaCl脱色后可以观察到菌落周围有明显透明水解圈的菌株进行下一步研究[5]。

2)摇瓶复筛 将筛选到的菌种由平板接到50 mL(250 mL三角瓶)液体培养基中，于28℃､210 r•min-1下培养24 h，制成种子液。然后按5%的接种量将种子液加到50 mL(250 mL三角瓶)相应液体培养基中，于28℃､210 r•min-1条件下培养48 h，将发酵的粗酶液在不同pH条件下测定酶活，选择酶活反应的最适pH偏碱性的菌株保藏备用。

1.2.2 纤维素酶活力的测定 取1.5 mL 0.05 mol•L-1醋酸缓冲液配制的1.0%羧甲基纤维素钠溶液，加入0.1 mL经5 000 r•min-1离心10 min所得的发酵液上清液，50℃反应20 min。用DNS法测定反应后还原糖(葡萄糖)含量，做空白对照扣除本底。酶活定义为上述条件下，1 mL发酵液1 min催化底物生成1 μmol葡萄糖的酶量为一个酶活力单位“IU”。

1.2.3 菌种鉴定 采用18S rRNA基因分析[5-7]:提取丝状真菌的DNA，用真菌核糖体DNA转录间隔区(ITS)通用引物(5′—TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC—3′和5′—GGA GAT AGT CGT AAC AAG G—3′)进行PCR 扩增，扩增产物纯化后经北京三博志远生物技术有限公司测序。

2 结果与分析

2.1 菌种筛选鉴定

取自碱性土壤､朽木的23份样本中经稀释涂布平板分离到能在pH值7.0~8.0的CMC-Na平板上生长的透明圈直径较大的真菌7株。摇瓶复筛，其中1株初始编号为t42的菌株在碱性条件下生长较快，最适酶反应pH值(内切酶活力在pH值7.5左右达最高)及菌株生长的耐碱性都要高于其他产纤维素酶的真菌(表1)，因而选用此菌株作进一步的研究。该菌株经北京三博志远生物技术有限公司测序，初步确定该菌株为镰刀霉菌(Fusarium sp)。

2.2 酶学性质的初步研究

2.2.1 酶反应的最适pH值 将t42的CMC酶液分别置于pH值5.5､6.0､6.5､7.0､7.5､8.0､8.5､9.0､9.5的HAC-NaAC缓冲液中测定CMC酶活力(图1)。结果表明，酶反应的最适pH值为7.5左右，且在pH值8.5也具有较高的酶活性。

2.2.2 酶的pH稳定性 将t42的CMC酶液分别置于不同pH值的HAC-NaAC缓冲液中，室温保持1 h后，按常规方法测定剩余酶活力(图2)，结果显示，t42的酶液在pH值7.0~8.5范围内，剩余酶活力可保持80%以上。

2.2.3 酶反应的最适温度 取t42的CMC酶液置于pH值7.5的HAC-NaAC缓冲液中，分别在30℃､35℃､40℃､45℃､50℃､55℃､60℃､65℃､70℃､75℃､80℃的温度条件下反应，测定酶活力(图3)。结果表明，该酶的最适反应温度为50℃，在40~55℃间具有相对较高的酶活力。

2.2.4 酶的热稳定性 将t42的CMC酶液在30℃､35℃､40℃､45℃､50℃､55℃､60℃､65℃､70℃､75℃､80℃各温度下保温1h后，按常规方法测定剩余酶活力(图4)，结果表明，该酶在经30~55℃温度范围内，酶活性可保持原活力的80%以上。说明该酶在55℃以下的具有较高的温度稳定性。

2.2.5 金属离子对酶活性的影响 在酶反应体系中加入不同的金属离子(0.01 mol•L-1)，测定CMC酶活力(图5)，结果显示，Mg2+､Mn2+和Zn2+对酶反应有促进作用，Pb2+和Cu2+对酶反应有抑制作用。

3 小结

从碱性土壤样品中筛选到1株能够产碱性纤维素酶的丝状真菌菌株t42，经18S rRNA基因分析，初步确定该菌株为镰刀霉菌(Fusarium sp)。研究t42的粗酶液的CMC酶的酶学性质表明，其最适作用pH分别为7.5，在pH7~8.5的范围内具较高的稳定性;反应温度以50℃左右为宜，且在50℃以下具有较高的温度稳定性。Mg2+､Mn2+和Zn2+对酶反应有促进作用，Pb2+和Cu2+对酶反应有抑制作用。该菌株产酶活力高､稳定性好，具较强的耐碱性。这些特性还未见报道，因而在洗涤剂､纺织､废水处理和制浆造纸工业等行业中有较好的应用前景。

参考文献:

[1] ZHANG Y， HIMMEL M， MIELENZ J. Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies[J]. Biotechnology Advances 2006，24:452-481.

[2] 刘森林，邢 苗，刘 刚，等.碱性纤维素酶革兰氏阴性菌株筛选及酶学性质研究[J].微生物学通报，2005，32(4):91-94.

[3] 郝 月，杨翔华，郝传德，等.秸秆纤维素分解菌的选育及发酵工艺研究[J].粮食与饲料工业，2006(3):32-33.

[4] 赵新刚. 洗涤用碱性纤维素酶及其产生菌的分离方法[J]. 微生物学通报，1999，26(1):64-65.

[5] 萨姆布鲁克 J，拉塞尔 D W.分子克隆实验指南[M].第3版.黄培堂，译.北京:科学出版社，2002

[6] 徐 昶，龙敏南，邬小兵，等.高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究[J].厦门大学学报(自然科学版)，2005，44(1):107-111.