三倍体虹鳟制种技术与倍性鉴定

摘要：虹鳟（Oncorhynchus mykiss）属鲑形目、鲑科，是重要的冷水性养殖鱼类，三倍体虹鳟以其不育或育性不良、肉质提升和生长周期缩短等特点得到养殖者的喜爱。尽管国内多地已经进行了三倍体虹鳟制种的研究，但效果并不理想，目前三倍体虹鳟苗种主要依靠国外进口。本文拟对三倍体人工诱导和倍性鉴定两个方面进行总结，以利于更有效地进行三倍体虹鳟规模制种。

关键词：虹鳟；三倍体；人工诱导；制种；倍性鉴定

虹鳟是世界主要的冷水性养殖鱼类，在我国已有50多年的养殖历史。近年来三倍体虹鳟受到养殖者青睐。与二倍体虹鳟相比，三倍体虹鳟体内有三套染色体，其性腺发育不良，因此生长快，肉质好，个体大，经济价值高。因为三倍体虹鳟雌性不育，不可通过培育亲鱼来繁殖后代，所以三倍体虹鳟的制种尤为重要。近年来我国北京、黑龙江、甘肃等地都开展了关于三倍体虹鳟制种的研究，但效果并不理想，不能满足规模化生产的需要。三倍体虹鳟的苗种仍需从美国等国外进口，进口的三倍体虹鳟虽然三倍体率较高，但价格昂贵，运输不便。下面介绍一下三倍体虹鳟的制备方法和倍性的鉴定方法。

1 三倍体虹鳟的制备

多倍体鱼类的产生是由于细胞内的染色体的加倍而形成。鱼类精子入卵的时间是在第二次成熟分裂的中期，受精后放出第二极体，如果卵子受精后因为各种因素刺激，导致第二极体不排出，即没有经过减数分裂形成二倍体卵核，直接与单倍体精核结合得到三倍体受精卵。常见诱导鱼类多倍体的方法主要可以分为物理法、化学法和生物学方法。

物理学方法的机制是破坏纺锤丝微管的形成，使应由微管蛋白聚合成的微管解体或阻止微管聚合这一过程，使染色体失去移动的能力，阻止染色体向两极移动，形成多倍体细胞。主要包括温度休克法、静水压法和电休克法，其中温度休克法因成本低、操作简单且无需专业设备而被广泛应用。一般冷水性鱼类采用热休克法，而温水性鱼类则采用冷休克法。

化学物质也可以用来阻止第二极体或第一极体的排出而产生三倍体，但目前使用化学法三倍体制种主要集中在贝类，在鱼类上研究甚少。主要使用的化学诱导剂有6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）、细胞松弛素B（CB）、咖啡因、聚乙二醇（PEG）和秋水仙素等。

生物学方法包括远缘杂交、核移植和细胞融合等。远缘杂交在鲤科鱼类应用较多，如吴维新用兴国红鲤和草鱼进行远缘杂交而获得了四倍体杂种。核移植诱导鱼类多倍体仍处于实验阶段，该技术很有可能为诱导四倍体鱼类开辟新的篇章。细胞融合是诱导鱼类囊胚细胞与囊胚细胞、囊胚细胞与卵细胞、胚囊细胞与受精卵、受精卵与受精卵之间的细胞融合，但由于细胞内染色体组发生重排，实际得到的鱼类细胞群往往是含有不同数量染色体的，不适合实际生产应用。目前，采用雌核发育、性别转换和三倍体生物学诱导相结合，成为培育三倍体全雌鱼的新技术。

目前物理方法中的温度休克法最为常用。Chourrout采用27-30℃的休克温度在虹鳟受精后70min作用10min，得到了三倍体幼鱼。Peter等在制备溪鳟三倍体时采用28℃的休克温度，在受精完成10min后，持续处理10min，得到98%-100%的三倍体，相对存活率为42%。Dube在对美洲红点鲑受精完成15min后，放入26℃的水中，处理时间不超过25min，得到了大量的三倍体幼鱼。王炳谦等在水温6.5℃的条件下，受精后20min，以26.6℃的休克温度处理虹鳟受精卵20min，也成功得到三倍体虹鳟。不同的实验条件和结果表明，获得虹鳟三倍体的最佳条件为：处理温度26.5℃，处理起始时间为受精后15min，处理持续时间为10min，其中处理时间为主要的影响因子。

人工诱导三倍体完成后，当胚胎发育至原肠胚时，计算受精率，方法是随机抽取20粒卵，放入装有鉴别液的培养皿中，作用3-5min后，肉眼见到有白色线状配体的为受精卵，做三次取平均值，按照受精卵所占的比例计算出受精率。鉴别液的配方为：氯化钠7g，冰醋酸50ml，蒸馏水1L。

发眼率为人工诱导的受精卵发育成发眼卵的数量与总卵数的比值。发眼卵的孵化和苗种培育条件同二倍体虹鳟相同。

2 三倍体虹鳟的倍性鉴别

除采用四倍体与二倍体杂交制种外，其它诱导方法三倍体鱼类的诱导率很难达到100%，而且常常表现为嵌合体，因此，鉴定倍性就显得尤为重要。倍性检测法分为间接法（包括生化分析、核体积测量、蛋白质电泳等）和直接法（包括DNA含量测定、染色体计数、核仁数目银染法等）。其中常用的为红细胞体积测量法、流式细胞仪检测法、染色体计数法和核仁数目银染法：红细胞体积的测量较为简单，广泛应用于多倍体生物的鉴定；流式细胞仪法可以准备、快速的测定DNA含量，但是检测成本较高，不适合规模生产上使用；染色体计数是鉴定多倍体倍性最准确的方法，但是比较费时，大多数用胚胎制作染色体标本；核仁数目银染法是利用细胞的核仁数目随染色体组的增加而按比例增加这一原理，来分析胚胎细胞的核仁分布情况，从而鉴定倍性。

红细胞体积法：采集三倍体虹鳟尾动脉外周血，制成血涂片，每尾鱼制10张血涂片，甲醇固定后，Giemas染色，镜下观察。在每张片子上随机选取20个红细胞，测量其长径a和短径b，计算平均值和标准差，根据公式V=a×b2×1.91-1计算红细胞体积。测得的三倍体虹鳟血细胞数据与二倍体虹鳟血细胞数据若与预期理论值（1.5：1）无显著差异，则证明所测样本为三倍体，制种成功。

流式细胞仪法：虹鳟尾静脉取血，用1%的肝素对针头进行抗凝处理，2000rpm离心10min，去上清，沉淀中加入70%乙醇固定过夜。隔天用PBS进行洗涤，2000rpm下离心5min，洗涤2-3次。用红细胞计数板将血细胞计数，并用生理盐水将血细胞稀释至107个/ml。每毫升稀释过的红细胞中加入200ul，20ug/ml的RNAse，37℃下孵育30min，冰浴中终止反应。然后加入200ul，40ug/ml的PI，4℃下避光染色15min，上流式细胞仪进行测定。本实验室前期实验，随机检测100尾诱导的三倍体虹鳟，与二倍体对照组进行比较，结果显示，检测的100尾虹鳟中，有75尾DNA含量约为72（对照组二倍体DNA含量约为48），说明三倍体诱导率为75%。

染色体计数法：取少量原肠期胚胎，放入培养皿中，加入100ppm秋水仙素溶液，处理24h。用箭头镊子戳破卵膜，使卵黄和囊胚游离于0.9%NaCl溶液中，后转入5ml离心管中，用习惯吹打均匀后500rpm离心5min，弃上清，再加入4ml0.9%NaCl溶液捶打均匀，离心，重复2次。离心后收集细胞，弃掉上清液，然后向每个离心管中加入0.4%NaCl溶液，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，34℃下低渗2h，每隔15min吹打一次。低渗2h后，向离心管中缓缓加入1ml预冷固定液，固定30min，每隔10min吹打一次。1000rpm离心8min，弃上清。加入3ml预冷固定液，固定30min，每隔10min吹打一次。1000rpm离心8min，弃上清，重复两次。再加入3ml固定液后置于-20℃冰箱过夜，离心管用橡胶塞盖严。取出过夜的固定后的细胞悬液，离心后，加入适当的固定液轻轻吹打均匀。取预先冰冻的载玻片甩掉冰水后迅速地上2-3滴细胞悬液，用嘴轻轻吹散细胞，自然干燥。用磷酸缓冲液稀释10倍配置的Giemsa染液扣染20min，蒸馏水冲洗干净，自然干燥后镜检观察染色体数，记录并拍照。

核仁数目银染法：取少量发眼卵浸泡在固定液中，处理4h。用箭头镊子取出少量胚胎，在载玻片上敲打均匀，自然晾干。将载玻片放在60℃加热板上，按照硝酸银与明胶2︰1的比例滴加在细胞附着区开始染色。待溶液变成褐色时，用温水冲洗载玻片，自然干燥后镜检。观察每个胚胎的核仁数目，记录并拍照。

以上四种方法中，红细胞体积法和流式细胞仪法因为需要尾静脉采血，须将人工诱导的虹鳟鱼苗饲养一个阶段才能做倍性鉴定，操作简单，成本较低，但周期较长。染色体计数法和核仁数目银染法在发眼卵期间就可以鉴定倍性，但样本被直接破坏，操作和设备要求高，成本高于前两种方法。在研究和生产中，根据实际情况，选取相应的鉴定方法，通常采用红细胞体积法和核仁数目银染法相结合的鉴定方法保证结果的准确率。确定倍性后可以剪掉脂鳍作为标记，以方便饲养管理。

3 总结

我国三倍体虹鳟制种技术研究已成功多年，但该项技术尚不成熟，诱导率不够稳定，也未能达到较大规模。分析原因主要有以下几点：一是亲鱼的质量不佳，导致受精卵质量不高；二是设备不够完善，受精卵在水浴处理时，水温不稳或分布不均；三是环境不符合要求，处理过程中未严格控制避光条件，使受精卵受到了外界光刺激；四是操作技术不够细致，震动过于激烈，导致死卵的产生。总之，只有处理好制种过程中各方面的细节问题，才能获得高质量的三倍体虹鳟鱼苗。

进一步优化三倍体制种方法，获得稳定的制种技术，提高三倍体虹鳟制种成功率，降低成本，以满足国内商业化生产的需要，将是我国冷水渔业近期急需解决的问题。